Keywords：T細(xì)胞活化擴(kuò)增；CD3/CD28抗體偶聯(lián)磁珠；IL-2；T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基；CD3+ T；CD4+ T;CD8+ T；小鼠免疫試驗(yàn)；T cell activation and expansion;Anti-CD3/CD28 antibody-conjugated magnetic beads; T Cell Expansion Medium; Cell Therapy；Mouse immunological experiments;

在基礎(chǔ)免疫學(xué)研究、腫瘤免疫模型構(gòu)建、CAR-T細(xì)胞療法臨床前研究等領(lǐng)域，小鼠是常見的體外模型。其中，小鼠T細(xì)胞作為核心研究對(duì)象，其體外高效活化與擴(kuò)增是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵前提。小鼠T細(xì)胞與人類T細(xì)胞具有同源性，其活化同樣遵循“三信號(hào)機(jī)制"，但因種屬特異性差異，對(duì)活化試劑、培養(yǎng)條件的適配性要求更為嚴(yán)苛。IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，依托多年細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)積累，針對(duì)小鼠T細(xì)胞特性優(yōu)化開發(fā)了包括CD3/CD28抗體偶聯(lián)磁珠在內(nèi)的全套活化擴(kuò)增試劑，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)流程與常見問題解決方案，為小鼠CD3/CD28介導(dǎo)的T細(xì)胞活化擴(kuò)增提供高效、穩(wěn)定、可重復(fù)的一站式解決方案，助力科研工作者高效推進(jìn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。

01    小鼠T細(xì)胞活化擴(kuò)增的“三信號(hào)機(jī)制"

T細(xì)胞活化擴(kuò)增的“三信號(hào)機(jī)制"是免疫學(xué)中的核心概念，它詳細(xì)描述了初始T細(xì)胞被完-全激活并增殖為效應(yīng)細(xì)胞所必需的三種協(xié)同信號(hào)。缺少其中任何一個(gè)信號(hào)，都將導(dǎo)致T細(xì)胞失能、凋亡或僅產(chǎn)生微弱反應(yīng)。

小鼠T細(xì)胞的完-全活化需依賴“三信號(hào)協(xié)同作用"，缺少任一信號(hào)均會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞失能、凋亡或增殖微弱，這一機(jī)制與人類T細(xì)胞活化原理一致，但需適配小鼠細(xì)胞的種屬特異性：

1. 第一信號(hào)（抗原特異性信號(hào)）：由小鼠T細(xì)胞表面TCR-CD3復(fù)合物與抗原呈遞細(xì)胞（APC）表面MHC-抗原肽復(fù)合物結(jié)合產(chǎn)生，是T細(xì)胞活化的“啟動(dòng)信號(hào)"，需通過抗小鼠CD3抗體特異性結(jié)合TCR-CD3復(fù)合物觸發(fā)。

2. 第二信號(hào)（共刺激信號(hào)）：由小鼠T細(xì)胞表面CD28分子與APC表面B7配體結(jié)合產(chǎn)生，是避免T細(xì)胞“免疫無(wú)能"、維持活化持續(xù)推進(jìn)的關(guān)鍵，需通過抗小鼠CD28抗體提供協(xié)同刺激。

3. 第三信號(hào)（增殖存活信號(hào)）：以IL-2（白細(xì)胞介素-2）為核心，作為關(guān)鍵細(xì)胞因子，其可特異性結(jié)合小鼠T細(xì)胞表面IL-2受體，激活下游JAK-STAT信號(hào)通路，推動(dòng)T細(xì)胞從G0靜息期進(jìn)入細(xì)胞周期，實(shí)現(xiàn)大量增殖的同時(shí)，維持細(xì)胞活性與功能穩(wěn)定性，促進(jìn)其分化為效應(yīng)T細(xì)胞或記憶T細(xì)胞，是小鼠T細(xì)胞擴(kuò)增的“能量核心"。

其中，CD3/CD28抗體偶聯(lián)磁珠是模擬體內(nèi)APC功能的最-優(yōu)工具，其通過模擬天然APC的粒徑與立體結(jié)構(gòu)，可與小鼠T細(xì)胞形成類免疫突觸的高效結(jié)合模式，實(shí)現(xiàn)更均勻、高效的活化效果，顯-著優(yōu)于傳統(tǒng)平板包被法，且磁珠的超順磁性特性便于后續(xù)分離去除，不干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)（如流式檢測(cè)、細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)等）。同時(shí)，針對(duì)小鼠T細(xì)胞的特性，抗小鼠CD3/CD28抗體經(jīng)過特殊處理，確保對(duì)細(xì)胞的直接刺激活性，避免有害成分干擾細(xì)胞功能。

02    小鼠CD3/CD28磁珠介導(dǎo)的T細(xì)胞活化擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)化流程

IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，為滿足基礎(chǔ)免疫學(xué)研究、腫瘤免疫模型構(gòu)建、CAR-T細(xì)胞療法臨床前研究等領(lǐng)域的快速發(fā)展需求，已開發(fā)、生產(chǎn)了小鼠T細(xì)胞活化擴(kuò)增所需的培養(yǎng)基（T Cell Expansion Medium）與小鼠CD3/CD28 T細(xì)胞活化擴(kuò)增磁珠（Anti-CD3/CD28 antibody-conjugated magnetic beads）等相關(guān)試劑。同時(shí)，為驗(yàn)證試劑的適用性，IPHASE技術(shù)人員使用IPHASE Mouse PBMC Isolation Kit （Cat.：071E100.11），從空白小鼠的全血中分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），后使用 IPHASE Mouse CD3/CD28TCells Activation/ Expansion Beads進(jìn)行 CD3+ T 細(xì)胞的擴(kuò)增。 具體流程及結(jié)果如下：

①將 IPHASE Mouse CD3/CD28 T Cells Activation/Expansion Beads 渦旋混勻。

②向PBMC中添加一半數(shù)量的 IPHASE Mouse CD3/CD28 T Cells Activation/ Expansion Beads,如 2x106個(gè) PBMC添加 25μL 的 IPHASE Mouse CD3/CD28 T Cells Activation/Expansion Beads .

③350g 離心 5min，去掉上清液，以含 200IU/mL 的 IL-2 的 Mouse T Cell Expansion Medium 重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度至 2×106cells/mL，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

④激活后第 1 天不做處理，第 2 天補(bǔ)充與第 0 天等體積的含 200IU/mL 的 IL-2 的 Mouse T Cell Expansion Medium 培養(yǎng)基，于第 3 天使用磁力架移除磁珠，按照 0.5-1×106cells/mL 的密度繼續(xù)在含 1000IU/mL 的 IL-2 的 Mouse T Cell Expansion Medium 中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

⑤每日觀察培養(yǎng)物，記錄細(xì)胞大小和形態(tài)特征。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物出現(xiàn)耗竭時(shí)，通常會(huì)觀察到細(xì) 胞收縮和增殖速率下降的現(xiàn)象。

上圖為按照如上操作得到的小鼠CD3+T細(xì)胞活化擴(kuò)增結(jié)果圖。IPHASE技術(shù)人員以300萬(wàn)PBMC為初始細(xì)胞，由圖左清晰可知，13天時(shí)，小鼠CD3+T細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)高達(dá)322倍；且為驗(yàn)證T細(xì)胞的純度，圖右為擴(kuò)增第九天時(shí)IPHASE技術(shù)人員使用了CD3+T和CD8+T細(xì)胞雙陽(yáng)抗體流式驗(yàn)證，純度可達(dá)95%。說明IPHASE小鼠T細(xì)胞活化擴(kuò)增相關(guān)試劑具有良好的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，值得客戶購(gòu)買！

03    小鼠T細(xì)胞活化擴(kuò)增常見問題及解決方案

小鼠T細(xì)胞活化擴(kuò)增是基礎(chǔ)免疫學(xué)研究、腫瘤免疫模型構(gòu)建等領(lǐng)域的常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作，應(yīng)用廣泛且流程日趨成熟，但在實(shí)際實(shí)操過程中，仍會(huì)因樣本處理、試劑使用、培養(yǎng)條件等多種因素出現(xiàn)各類問題，影響實(shí)驗(yàn)效率與結(jié)果可靠性，以下結(jié)合實(shí)操經(jīng)驗(yàn)，梳理常見問題并給出針對(duì)性解決方案，助力科研工作者高效推進(jìn)實(shí)驗(yàn)。

Q1：T細(xì)胞活化效率低，無(wú)明顯增殖的原因是什么？

常見原因：

①CD3/CD28磁珠與細(xì)胞比例不當(dāng)（磁珠過多/過少）；

②IL-2濃度不足或失效（IL-2需低溫保存，反復(fù)凍融易失效）；

③培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)不足或未適配小鼠T細(xì)胞；

④細(xì)胞初始活率過低（<85%）；

⑤孵育溫度、CO?濃度異常；

⑥磁珠與細(xì)胞孵育時(shí)間不足。

解決方案：

①調(diào)整磁珠與細(xì)胞比例至1:1（小鼠T細(xì)胞最-優(yōu)比例，避免磁珠過多抑制細(xì)胞活力），孵育時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)，確保磁珠與細(xì)胞充分結(jié)合；

②IL-2需-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融，使用前快速?gòu)?fù)溶，配制后立即使用，活化階段終濃度200IU/mL，擴(kuò)增階段1000IU/mL；

③更換IPHASE小鼠專用T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，添加專用培養(yǎng)基組分，補(bǔ)充特異性營(yíng)養(yǎng)因子；

④分選前篩選活率≥85%的PBMC，可使用死細(xì)胞去除磁珠去除死細(xì)胞；

⑤嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件：37℃、5% CO?，飽和濕度，避免溫度波動(dòng)；

⑥若活化后細(xì)胞無(wú)明顯增殖，可補(bǔ)充少量新鮮IL-2，延長(zhǎng)擴(kuò)增周期1-2天。

Q2：擴(kuò)增過程中細(xì)胞活率持續(xù)下降？

常見原因：

①細(xì)胞密度過高，代謝廢物堆積；

②培養(yǎng)基更換不及時(shí)，營(yíng)養(yǎng)耗盡；

③IL-2濃度過高，產(chǎn)生毒性；

④磁珠未及時(shí)移除，持續(xù)刺激導(dǎo)致細(xì)胞耗竭；

⑤培養(yǎng)環(huán)境被污染（細(xì)菌、真菌）；

⑥細(xì)胞分選過程中損傷嚴(yán)重。

解決方案：

①每日監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度，當(dāng)密度超過2×10?cells/mL時(shí)，及時(shí)稀釋；

②每3天更換1次新鮮完-全培養(yǎng)基，及時(shí)去除代謝廢物；

③調(diào)整IL-2濃度，擴(kuò)增階段不超過1000IU/mL，避免毒性作用；

④活化后第3天及時(shí)用磁力架移除磁珠，操作輕柔，避免損傷細(xì)胞；

⑤嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作，培養(yǎng)器材高壓滅菌，培養(yǎng)基使用前檢測(cè)有無(wú)污染，若發(fā)現(xiàn)污染，立即終止培養(yǎng)，更換試劑重新實(shí)驗(yàn)；

⑥分選過程中動(dòng)作輕柔，避免反復(fù)吹打細(xì)胞，離心速度不超過350g，減少細(xì)胞損傷。

Q3：不同批次實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異大，可重復(fù)性差？

常見原因：

①小鼠個(gè)體差異（年齡、體重、健康狀況不同）；

②試劑批次差異，未進(jìn)行批次驗(yàn)證；

③實(shí)驗(yàn)操作不規(guī)范（孵育時(shí)間、溫度、離心速度不一致）；

④培養(yǎng)基配制不規(guī)范，IL-2濃度不準(zhǔn)確；

⑤分選條件不統(tǒng)一。

解決方案：

①選用同品系、同年齡（6-8周齡）、體重相近的健康小鼠，每組實(shí)驗(yàn)至少3只，減少個(gè)體差異；

②使用IPHASE同一批次試劑，實(shí)驗(yàn)前對(duì)試劑進(jìn)行活性驗(yàn)證；

③嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)化流程，固定孵育時(shí)間、溫度、離心速度等參數(shù)，分選緩沖液、培養(yǎng)基配制嚴(yán)格按比例操作，做好實(shí)驗(yàn)記錄；

④IL-2配制后立即使用，避免放置時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致活性下降；

⑤統(tǒng)一分選策略（如均采用陰選法）和分選柱型號(hào)，確保分選條件一致。

04    IPHASE產(chǎn)品

綜上所述，小鼠T細(xì)胞活化擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)應(yīng)用廣泛且流程日趨成熟，但仍有較多試驗(yàn)問題亟待解決。鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，研發(fā)、生產(chǎn)了高質(zhì)量小鼠T細(xì)胞活化擴(kuò)增相關(guān)試劑，包含小鼠CD3/CD28 T細(xì)胞活化擴(kuò)增磁珠（Anti-CD3/CD28 antibody-conjugated magnetic beads）、T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基（T Cell Expansion Medium）及重組IL-2等產(chǎn)品，是科研人員的不二-選擇！

除小鼠T細(xì)胞活化擴(kuò)增相關(guān)試劑外，IPHASE技術(shù)人員也開發(fā)出人T細(xì)胞活化擴(kuò)增及全套免疫細(xì)胞相關(guān)試劑，為客戶的細(xì)胞治療研究提供一站式服務(wù)！產(chǎn)品列表如下：

IPHASE生產(chǎn)產(chǎn)品均具有以下優(yōu)勢(shì)：

 合規(guī)性 生產(chǎn)產(chǎn)品的組織均由正規(guī)渠道獲得，來(lái)源清晰。

 安全性 生產(chǎn)組織均經(jīng)過病原檢測(cè)，保證產(chǎn)品質(zhì)量安全。

 高質(zhì)量 生產(chǎn)產(chǎn)品均經(jīng)過嚴(yán)格的內(nèi)部質(zhì)控，且同批次數(shù)量多，批次間差異性小。

 可定制 可根據(jù)客戶特殊需求，提供定制服務(wù)。